在RNA-Seq等测序设计中，生物学重复和技术重复，是非常需要注意的问题。
那么问题就来了，生物学重复和技术重复，到底是什么？它们是如何影响我们的实验设计的。
生物学重复（biological replicate）：可以理解为我们对一个群体进行研究，但是我们不会对整个群体进行检测（考虑到成本和工作量的问题，我们肯定也不会采取这种地毯式的方法），只是抽取群体中的一部分进行检测，用样本来代表总体。
这边样本个数，实际上就是生物学重复数。
技术重复（technical replicate）：对一个样本的数值进行多次测定。
下表给出常见实验对应重复类型：
实例
Replication这篇文章以测定小鼠肝脏细胞中的某一个gene的表达量为例，展示了什么是生物学重复和技术重复以及如何权衡这两者之间的关系。
分别给出3种类型的重复，分别为：
（1）animal水平的重复
（2）cell水平的重复
（3）技术重复
由上图可以得到，3种不同种类的重复，所计算出来的表达量方差是不一样的，但gene表达量的总方差，可以有下列公式计算得到：
σ T O T 2 = σ A 2 + σ C 2 + σ M 2 σ_{TOT}^2 = σ_{A}^2 + σ_{C}^2 + σ_{M}^2 σTOT2=σA2+σC2+σM2
接下来，将总体的重复次数限定，即在满足 n A ∗ n C ∗ n M = 48 n_{A}*n_{C}*n_{M}=48 nA∗nC∗nM=48的前提条件下，对Var(X)进行计算。
n A n_{A} nA代表动物样本数， n C n_{C} nC代表细胞样品数， n M n_{M} nM代表技术重复次数， V a r ( X ) Var(X) Var(X)是基因表达量误差
V a r ( X ‾ ) Var(\overline{X}) Var(X)（ V a r ( X ) Var(X) Var(X)的变式，含义是the precision in the expression mean，计算公式为 σ A 2 n A + σ C 2 n A n C + σ M 2 n A n C n M \frac{σ_{A}^2}{n_{A}} + \frac{σ_{C}^2}{n_{A}n_{C}} + \frac{σ_{M}^2}{n_{A}n_{C}n_{M}} nAσA2+nAnCσC2+nAnCnMσM2
1、当 n A n_{A} nA和 n M n_{M} nM均为1， n C n_{C} nC为48的情况下，计算出来的Var(X)如下图标记：
这种情况下，只反映了由于cell样品重复和技术重复所引起的基因表达量误差。当n_{A}=1（动物样品数为1），即无法计算由于animal样品数变化，所带来的基因表达量误差。
因此在上述情况下， σ T O T 2 （ V a r ( X ) ） σ_{TOT}^2（Var(X)） σTOT2（Var(X)）就被低估了。
2、当 n A n_{A} nA和 n C n_{C} nC均为1， n M n_{M} nM为48的情况下
计算得到的基因表达量误差完全是由于技术重复所引起的。因此，如果我们将这种情况下的误差，认定为由生物重复所引起的，就造成了假阳性。
作者在文章中，还指出了非常重要的一点：虽然增加技术重复，可以让我们对σ_{M}2有一个更准确的估计，但是没必要。因为提升动物样品数，可以使σ_{M}2可忽略不计（以Var(\overline{X})）。
同时，需要注意的是，将是样品放入同一批次进行测序，减少批次效应对数据的影响。
同样地，每一种重复对于真实基因表达量的方差贡献也不是相同的。
因为cell重复和测定技术重复，并是一个独立变量。技术重复本质上是对同一份样品进行测定，数据在这种情况下的变异，完全是由于人为或机器造成的，而cell重复在本质上可以认为与animal样品之间存在相关性，因此也不是独立的。
3、从 V a r ( X ‾ ) Var(\overline{X}) Var(X)的角度，来选择replicate
【标注】 V a r ( X ‾ ) Var(\overline{X}) Var(X)越小，代表对 V a r ( X ) Var(X) Var(X)估计越准确
可以看到的是，当增大animal重复数时， V a r ( X ) Var(X) Var(X)趋于一个稳定值，该样本对总体的估计达到了一个较为准确的水平，同时 V a r ( X ‾ ) Var(\overline{X}) Var(X)的值也接近于0。
4、从统计检验的角度，来选择replicate
使用two-sample t检验，来判断cell样品的gene表达量方差、动物样品表达量均值之间是否存在显著差异。
下图很明显的一个结果就是，随着 n A n_{A} nA的增加，统计检验的效能得到提升，假阳性也降低了（同时也得权衡 n A n_{A} nA和 n B n_{B} nB）
总结
对于一组数据来说，研究对象的生物重复本身所包含的影响比技术重复大，因此在进行实验设计时，最好将实验/测序资源倾向这边，而不是技术重复（除非对技术重复所诱发的影响感兴趣）文章来源：https://www.toymoban.com/news/detail-446403.html
参考资料
[1] 刘小乐老师-哈佛计算生物学与生物信息学
[2] Blainey P, Krzywinski M, Altman N. Points of significance: replication[J]. Nature methods, 2014, 11(9): 879.文章来源地址https://www.toymoban.com/news/detail-446403.html
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