实验技术—测序数据不好,可能是建库出了问题?(上)

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回顾

        在建库之前,我们需要对先前提取的核酸进行质检。只有质检合格的样本才能继续建库、测序、分析。(质检的内容在上一章节也有描述)这里再回顾下质检的内容主要分以下几部分:

1.  凝胶电泳实验: DNA是否降解 ,是否有其他的污染(跑胶, 与marker条带比较)

2. 紫外分光光度计测OD值: 检测提取DNA纯度情况(OD260/OD280比值约接近1.8,说明提取DNA纯度越高)

3. Qubit浓度定量。

DNA文库构建

常规基本的步骤有:1 DNA的片段化、2: 末端补平,3 端加A 、4  连接测序接头、5 PCR扩增和纯化。

实验技术—测序数据不好,可能是建库出了问题?(上)

01 DNA的片段化

        建库的第一步就是获得片段大小合适的DNA分子,那么就需要对DNA 进行打断.

问题:那么问题来了,DNA打断多少bp合适?

        1.取决于测序仪,比如准备上PE150, 那么打断的片段可以在300bp左右,比如上SE50,只要打断50~100bp即可;(这里没有理解的话,要和测序原理联系起来)

        2.取决测序的目的,如果我们测序的reads是用于组装,这样我们可以将打断到250左右,有更多的overlap区域,便于我们数据组装,可变剪切。

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片段化的方法主要分酶法打断超声波打断

        酶法打断: 用限制性内切酶特异性识别并切割磷酸与脱氧核糖之间的化学键,需要控制酶切时间和酶量。优势:高通量可一次性做多个样本,易操作;劣势:偏好性严重,对样本的质量要求严苛。

        超声波打断:自适应聚焦声波在样本中造成气穴现象从而机械随机的切断DNA,长片段的DNA,受到的剪切力比较大。优势:片段随机打断,无偏好性。劣势:成本高,机械损伤大。

问题:什么情况如何选择酶法打断和超声波打断?

        1.根据样本的情况:比如起始量低(低于50ng以下)  这种情况 不宜用机械打断,机械打断对样本损伤比较大,损失更多样本导致建库失败。更适合用酶切的方法;

        2.实验的目的和需求:比如甲基化测序、Chip-Seq 测序更适合用机械打断。

打断存在的问题:片段化不足与过度

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