Seurat | 强烈建议收藏的单细胞分析标准流程（基础质控与过滤）（一）-Toy模板网

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1. 写在前面

作为现在最火的scRNAseq分析包，Seurat当之无愧。😘
本期开始我们介绍一下Seurat包的用法，先从基础质控和过滤开始吧。🥳

2.用到的包

rm(list = ls())
library(Seurat)
library(tidyverse)
library(SingleR)
library(celldex)
library(RColorBrewer)
library(SingleCellExperiment)

3. 示例数据

3.1 读取10X文件

这里我们提供一个转成gene symbols的可读文件，如果大家拿到的是Ensemble ID，可以用之前介绍的方法进行转换。

adj.matrix <- Read10X("./soupX_pbmc10k_filt")

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3.2 创建Seurat对象

srat <- CreateSeuratObject(adj.matrix,project = "pbmc10k") 
srat

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3.3 查看Seurat对象

str(srat)

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4. 提取meta.data

这里我们提取一下meta.data，顺便查看一下表头，主要是三列: 👇

dataset ID；
UMI/cell (nCount_RNA);
detected genes/cell (nFeature_RNA)。

meta <- srat@meta.data
head(meta)

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5.添加信息

5.1 添加线粒体基因信息

不知道大家还记得线粒体基因吗???🤒
在scRNA-seq中，线粒体基因高表达往往代表细胞状态不佳。🧐

srat[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(srat, pattern = "^MT-")

head(srat$percent.mt)

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5.2 添加核糖体基因信息

这里我们试一下添加核糖体基因的信息。👀

srat[["percent.rb"]] <- PercentageFeatureSet(srat, pattern = "^RP[SL]")

head(srat$percent.rb)

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6. 去除双细胞

scRNAseq的理想情况是每个barcode下只有一个细胞，但在实际情况中会有两个或多个细胞共用一个barcode，我们称之为doublets。🫠

识别并去除doublets的方法很多，常用的有：👇

Scrublet;

doubletCells;

cxds;

bcds;

Hybrid;

DoubletDetection;

DoubletFinder;

Solo;

DoubletDecon。

这里推荐大家使用DoubletFinder，我们就不进行演示了，以后再做具体介绍。🤗

因为我们事先使用Scrublet做过处理了，这里就直接导入准备好的文件吧。

doublets <- read.table("./scrublet_calls.tsv",header = F,row.names = 1)
colnames(doublets) <- c("Doublet_score","Is_doublet")
srat <- AddMetaData(srat,doublets)
head(srat[[]])

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7. 可视化

7.1 小提琴图

这里我们用VlnPlot探索一下特征的分布情况。

VlnPlot(srat, 
        fill.by = "feature", # "feature", "ident"
        features = c("nFeature_RNA","nCount_RNA","percent.mt","percent.rb"),
        ncol = 4, pt.size = 0.1) +
  theme(plot.title = element_text(size=10))

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7.2 散点图

这里利用散点图，我们看一下不同变量间的相关性。

FeatureScatter(srat, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")

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FeatureScatter(srat, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")

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FeatureScatter(srat, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.rb")

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FeatureScatter(srat, feature1 = "percent.rb", feature2 = "percent.mt")

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FeatureScatter(srat, feature1 = "nFeature_RNA", feature2 = "Doublet_score")

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Note!

这里我们可以看到高线粒体基因与低UMI计数相关，可以理解为死细胞。 🫠
再看一下核糖体基因与线粒体基因，显著负相关。 😉
doublet和基因表达数之间也有一定的相关性。

8. 添加信息

8.1 过滤

接着我们定义一下过滤条件，将质量差、非单细胞的数据剔除掉。🫵

srat[['QC']] <- ifelse(srat@meta.data$Is_doublet == 'True',
                       'Doublet','Pass')

srat[['QC']] <- ifelse(srat@meta.data$nFeature_RNA < 500 & 
                       srat@meta.data$QC == 'Pass',
                       'Low_nFeature', srat@meta.data$QC
                       )

srat[['QC']] <- ifelse(srat@meta.data$nFeature_RNA < 500 & 
                       srat@meta.data$QC != 'Pass' & 
                       srat@meta.data$QC != 'Low_nFeature',
                       paste('Low_nFeature', srat@meta.data$QC, sep = ','),
                       srat@meta.data$QC
                       )

srat[['QC']] <- ifelse(srat@meta.data$percent.mt > 15 &
                       srat@meta.data$QC == 'Pass',
                       'High_MT',srat@meta.data$QC
                       )

srat[['QC']] <- ifelse(srat@meta.data$nFeature_RNA < 500 &
                       srat@meta.data$QC != 'Pass' & 
                       srat@meta.data$QC !='High_MT',
                       paste('High_MT',srat@meta.data$QC,sep = ','),
                       srat@meta.data$QC
                       )

table(srat[['QC']])

8.2 可视化

这里我们只将通过过滤条件的数据展示出来，大家可以和过滤前的比较一下。

VlnPlot(subset(srat, subset = QC == 'Pass'), 
        features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt","percent.rb"), 
        ncol = 4, pt.size = 0.1) +
  theme(plot.title = element_text(size=10))

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